免疫磁珠共沉淀步骤-co-ip
Source:羧基磁珠Author:admin Addtime:2019/04/25 Click:
一、细胞裂解
1、转染后24-48 h收获细胞,用冷的PBS(4°C)洗细胞三次,最后一次吸干PBS;
2、加入适量(500μl)预冷的细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min;
3、用预冷的细胞刮将细胞从培养瓶上刮下,将裂解液收集到1.5mlEP管中,4°C、14000rpm)离心30 min后取上清;
4、取少量(20μl)裂解液以备western blotting分析;
二、准备磁珠
5、将Dynabeads完全重悬;
6、吸取50μl(1.5mg)Dynabeads到一个EP管中;(准备两份,一份结合抗体,
7、将EP管放在磁力架上,将Dynabeads从溶液中分离出来,吸去上清;
8、再用预冷的lysis buffer 500μl洗三次,每次都用磁力架将Dynabeads分离出EP管从磁力架上取下来;
三、结合抗体
9、取10μl的Antibody(Ab),加入到准备好Dynabeads的EP管中;
10、4°C旋转、孵育5h;
11、将EP管放在磁力架上,把Dynabeads-Ab复合物从溶液中分离出来,吸去
12、用冷的lysis buffer 1000μl洗三次,最后一次尽量吸尽上清,再加入25μllysis buffer和0.2μl的10%叠氮化钠;
四、免疫共沉淀
13、在裂解好的细胞样品500μl(步骤3)中加入Dynabeads(步骤6)25μl中,
C旋转2h(去除非特异性蛋白);
14、将EP管放在磁力架上,收集上清;
15、将上清加入预处理的Dynabeads-Ab复合物中,轻轻重悬Dynabeads-Abs复合物。
16、4°C旋转、孵育2h,让Ag与Dynabeads-Abs复合物结合;
17、将EP管置于磁力架上,转移上清到一个新的EP管中,以备需要时进一步
18、用1000μl的lysis buffer洗Dynabeads-Ab-Ag复合物三次,每次清洗后在磁移去上清,再温柔地重悬复合物;(Avoid co-elution of proteins bound)
五、洗脱目标蛋白
19、将EP管放在磁力架上,吸去上清;
20、加入20μl的2×SDS 上样缓冲液,轻轻重悬Dynabeads-Ab-Ag复合物;
21、50°C加热10min;
22、将EP管放在磁力架上,取上清作为样品,SDS-PAGE电泳。
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