Source:生物磁力架Author:admin Addtime:2018/08/06 Click:
本手册用磁珠浓度超高的Sera-Mag Magnetic SpeedBeads制作比Ampure XP beads价钱低约49倍的磁珠。
药品
Tris；EDTA；蒸馏水；Sera-Mag Magnetic SpeedBeads 磁珠（Fisher 09-981-123）；PEG-8000；NaCl；Tris-HCl；Tween 20；AGAROSE G-10；0.5X TAE；Thermo Scientific GeneRuler 50 bp DNA Ladder；Thermo Scientific 6X DNA Loading Dye；Solarbio GoldViewⅡ型核酸染色剂（5000x）；无水乙醇；超纯水
器材
锥形瓶；量筒； 电泳仪； 分析天平；1.5ml EP管；96孔板；磁力架；移液枪及枪头；排枪；一次性塑料手套；隔热手套；微波炉；离心管架等
01
磁珠制作
1. 在50 mL灭菌后的锥形瓶中，准备TE溶液（500μL 1M Tris pH8 + 100μL 0.5M EDTA,用蒸馏水定容至50mL）。
2. 充分涡旋振荡磁珠，转移1mL到1.5mL 离心管中。
图一：Sera-Mag Magnetic SpeedBeads （Fisher 09-981-123）（半成品）
3. 将离心管置于磁力架上，直到磁珠被聚集成球，被吸附到侧壁上。
图二：磁力架（www.ex-dna.com）
4. 用移液枪移去上清液，注意：不要碰到磁珠。
5. 加1mL TE 到离心管中，从磁力架上拿下离心管 ，充分涡旋振荡，混合均匀，再放回磁力架上。
6. 重复4、5 、4步骤。
7. 加1mL TE 到离心管中，从磁力架上拿下离心管，充分涡旋振荡，混合均匀，放置到离心管架上（不是磁力架）。
8. 加入9g PEG-8000到一个新的50mL 灭菌锥形瓶中。
图三：PEG-8000
9. 加入10mL 5M NaCl （或者2.92g）到锥形瓶中。
10. 加入500μL 1M Tris-HCl 到锥形瓶中。
11. 加入100μL 0.5M EDTA 到锥形瓶中。
12. 用蒸馏水补齐锥形瓶至大约49mL。用眼睛观察，小心谨慎操作。
13. 混合3-5分钟直到溶液澄清透明，固体充分溶解。
14. 加入27.5 μL Tween 20 到锥形瓶中，轻轻混合均匀。
图四：TWEEN 20
15.将7步骤中的共1 mL的磁珠和TE溶液转移加入到14步骤中的锥形瓶中。
16.用蒸馏水定容至50 mL （如果液体未达到50mL），轻柔的混合均匀。
图五：自制磁珠（完成品）
17.避光4℃保存。
注：新制作后的磁珠必须进行试用跑胶测试。
02
磁珠分选DNA效果测试
表一：不同体积比下磁珠与DNA量
1. 准备试剂：
用2个50ml离心管分别盛装超纯水和80%乙醇（配置80％乙醇：40ml无水乙醇+10ml超纯水。现用现配）
3个1.5ml EP管，分别标记“1” “2” “DNA”
2. 1号EP管-不加磁珠的空白对照：1μl Ladder+9μl超纯水
2号EP管-跑胶用Loading Dye：1μl Loading Dye +9 μl超纯水（因制胶时使用 Solarbio GoldViewⅡ型核酸染色剂（5000x）的要求，Loading Dye需再稀释10倍）
DNA管： 9.6μl Ladder+150.4μl超纯水（实际准备8份DNA量，每份1.2μl Ladder+18.8μl超纯水，防止药品不足或实验失误。）
图六：Thermo Scientific GeneRuler 50 bp DNA Ladder
图七： Thermo Scientific 6X DNA Loading Dye
3．从4度冷藏箱中取出避光保存的磁珠，涡旋混匀。
取一个96孔板，按照上表用量加入DNA和磁珠，加好后用移液枪反复吸吐混匀。
混匀后静置2min，然后将96孔板放置到磁力架上。
图八：上：96孔板
下：磁力架（实验室自制）
注意：移动96孔板的过程中手套不要接触孔口，避免污染DNA.
4. 放上磁力架等待一段时间，可以看到溶液呈透明。此时用移液枪将上清液吸出弃去。
注意：吸出上清液时，移液枪不要碰到磁珠。建议枪头轻微偏向磁珠的反方向。
5. 用排枪吸取80%乙醇200μl，加入六个孔中，静置1min（计时器计时）。
1min后用排枪吸出乙醇弃去
再用排枪吸取80％乙醇200μl，加入六个孔中。加入后，即可用移液枪将乙醇吸出（不需要静置），并且要求吸干乙醇,尽量没有残留。
将孔板拿下磁力架，静置直至孔内壁没有水珠。
注意：最后一步静置晾干时不能太干，时间控制在3~10min，如果孔壁内有较大液珠，可以用移液枪吸出，同时要求不能接触磁珠
6. 晾干后，用移液枪向每孔中各自加入20μl超纯水，并反复吸吐10次以上，保证混匀。
7. 将96孔板放上磁力架，可以看到溶液在短时间内变澄清。
8. 用移液枪吸出上清液，分别移至对应编号的新孔中。此时得到的是磁珠上吸附的也是我们所需的DNA
注意：吸出上清液时一定不要吸出磁珠。为了避免这种情况，可以适当调小移液枪如调至19μl
03
点样
1. 使用前将1号EP管（未加磁珠的Ladder对照）和2号EP管（稀释好的Loading Dye）中的液体反复吸吐混匀
2. 因为点样的量很少，所以在干净的一次性塑料手套上混合好样品。
孔1~6: 5μl DNA （磁珠过滤后）+1μl 2号EP管（稀释好的Loading Dye）
孔7： 3μl 1号EP管（未加磁珠的Ladder对照）+1μl 2号EP管（稀释好的Loading Dye）+2μl超纯水
注意：点样时移液枪中不要有气泡，避免气泡将孔内DNA带出，跑胶没有结果
枪头不要戳破胶
04
跑胶
电泳仪参数设置为180V 30min
在这个实验中作为对比的DNA Ladder与用于检验磁珠吸附能力的DNA均是原Ladder稀释20倍所得；Loading Dye是原药剂稀释60倍所得。
05
结果
图九：跑胶结果图（不同体积比的磁珠与DNA对应筛选出的DNA片段大小）
相关文献
1. 磁珠官方介绍手册：https://www.ex-dna.com
2. 原始实验手册为印第安纳大学伯明顿分校生物系 Kimberly Young所提供
生物磁力架，氨基羧基硅基羟基链霉亲和素磁珠：www.ex-dna.com
