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河南省洛阳市洛阳国家大学科技园
虽然Easysep细胞分选简单快捷，但是还是涉及到很多操作步骤。对初学者而言，有些地方意义不清楚，不知其所以然。本文以 human T 细胞分选为例，逐步解说每一个操作步骤的注意事项、窍门和背后的意义。
一 试剂盒的组分
试剂盒由两部分组成，抗体和磁珠，因为是分开的，所以有效期比较长。
重点：保存在2-8C，不要冷冻。
二 样品的准备
如果是新鲜外周血，最常用的方法就是用淋巴细胞分离液做密度梯度离心，制备PBMC。如果想速度快一点，可以用Sepmate 管子。
经常有小伙伴问，做完密度梯度离心之后，还残留一点红细胞怎么办？离心之后，上面还有一层薄薄的红细胞，怎么办？
答：通常来说，没有关系。如果真的残留太多，到了红细胞和白细胞1:1的时候，可以再裂红。
如果是冻存的PBMC又该如何处理呢？上面推荐了DNaseI处理。为何？
答：冻存的细胞在复苏之后，不可避免的出现死细胞，会释放DNA，那团粘糊糊的东西就是DNA了，这团粘糊糊的DNA会非特异的结合磁珠，会让细胞成团，因此对纯度和得率都会造成影响。用DNA酶降解一下就好了。
重悬的细胞密度，在本文举例的是5X10^7，但并非所有试剂盒都如此，需要看每个试剂盒对应的说明书。细胞密度和反应的时间非常相关，因此不要随意的改变，细胞变得太稀，反应的速率肯定收到影响。
有医院的小伙伴可以拿到白细胞采集物，就是上面说的Leukapheresis，按照上面的说明操作就可以了。
我们推荐的细胞分选缓冲液，可以买，也可以自己配。自己配，注意的一点就是，EDTA不好溶解，可以先配好500mM的母液，然后再加入。加入EDTA之后，pH值会变，需要重新调回来。
EDTA是为了防止细胞聚集，FBS为了保护细胞的活性。
三 分选操作步骤
注意事项：
1 需要用圆底离心管，磁力会随着距离迅速衰减。
2 绝大多数情况下，Easysep18000磁极就可以了，2ml的体积，1X10^8的细胞，相当于100ml的外周血。通常情况下，同学们能够拿到5-10ml的外周血。因此用18000磁极就可以满足大多数的分选需求。但是如果是用Easysep Direct 产品分选全血，那就另当别论，建议用15ml的18001大磁极。
Step 1 如果细胞量太少，调整到所需的密度，体积不到上面的最小体积0.25ml怎么办呢？按照最低的buffer量重悬，抗体量也按照最低的量来加。
Step 3 Votex磁珠这一步非常关键，用移液器反复吹打不好使，不好使。如果坚持反复吹打，最终的结果，可能就是磁珠越来越少，结果越来越差。
step 5 Top up to 2.5ml的意思，就是加入buffer的量最终到2.5ml。
step 6 连续的一个倾倒的动作，不要抖动，不要晃动，最后一滴不要滴下来。
如果是阴选，分选做到第六步就结束了。
如果是阳选：倾倒上清之后，再加入2.5ml的buffer 放入磁极3分钟，再倾倒上清，清洗三次。
