Source:adminAuthor:admin Addtime:2023/07/19 Click:
免疫磁珠分选细胞
实验原理
用免疫磁珠做细胞分选是高效简捷的免疫细胞及其它细胞的分离纯化方法， MACS
（magnetic-activated cell sorting）磁珠分选的原理：MACS 分选是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在分选柱内，而无该种表面抗原的细胞由于不能与连接有磁珠的特异性单抗相结合而没有磁性，不在分选柱内停留，进而使细胞得以分离。分为有柱式分选和无柱式分选。
分选策略包括：
(1) 阳性分选（磁珠标记的细胞为目的细胞）
① 目的细胞被磁性标记后，作为阳性标记组分直接分选出来。
② 分选后的细胞不必去除 MACS 微珠，可立即用于培养或者后续操作。该方法可以将磁
性标记的靶细胞富集 10000 倍。
③ 阳性分选策略优点：纯度高，回收率高，操作迅速、简便。
(2) 去除分选/阴性分选（磁珠标记的细胞为非目的细胞）
① 是把非目的细胞磁性标记后从细胞混合物中去除的方法，即未磁性标记的细胞为目
的细胞。
② MACS 分选柱技术加上强磁性标记可以去除高达 4 个对数级的细胞。
③ 去除分选策略适用范围：去除不需要的细胞;缺乏针对目的细胞的特异性抗体(如肿
瘤细胞);不需要抗体和目的细胞结合，即细胞不被激惹(如 T 细胞、B 细胞、NK 细胞功能分析);复合分选的一部分。
(3) 多重分选策略-获得多参数细胞，一般是先“阴性分选”再“阳性分选”
① 细胞亚群的分选，可以先磁性标记非目的细胞，去除分选后对阴性组分再行磁性标
记和阳性分选。
② 适用范围：在细胞悬液中，非目的细胞也表达用来阳性选择目的细胞的抗原，就需
要先去除这群非目的细胞;如果要分选非常稀有细胞，先从细胞悬液中去除非目的细胞，在富集细胞的基础上，进行阳性分选，可获得高纯度目的细胞。
(4) 多重分选
① MACS 多重分选是一种根据多种表面标志磁性分选细胞的技术。
② 多重分选中，首先用 MACS 多选微珠标记目的细胞，进行第一参数阳性分选。然后细
胞与多选解离试剂共同孵育，后者可以将微珠从抗体上酶性解离下来。接着使用针对另一细胞表面标志的抗体-微珠复合物磁性标记阳性分选细胞。二次标记的细胞可以再次进行阳性分选或者去除分选。
(5) REAlease 磁珠分选
① REAlease Microbeads 是一类基于重组基因工程改造抗体而研发的新型磁分选产品，
使用方便，磁珠和标记的抗体片段均可灵活去除。
② REAlease 磁珠操作步骤
步骤 1：细胞标记：细胞先后被 REAlease 复合体（抗体片段-生物素）和抗生物素磁珠
标记
步骤 2：磁性分离：阳性细胞被滞留在梯度磁场中，阴性细胞自然流穿
步骤 3：磁珠去除：用 REAlease Bead Release 磁珠解离试剂洗脱，在洗脱目的细胞的
同时，磁珠与细胞分离，获得带抗体标记的目的细胞
步骤 4：抗体标记去除：用 REAlease Release 试剂处理细胞，将细胞表面的抗体复合
物解离。（如果您需要直接对目的细胞进行流式检测，可以省略该步骤，利用细胞表面抗体标记直接检测目的细胞）
实验目的
将特定的细胞从细胞群体中分选出来。以下以从人外周血中阳性分选获得 T 细胞为例。
实验步骤
制备样本：通过密度梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
磁珠与样本进行孵育：
注意：
1.说明书上建议的体积用量适用的细胞数量≤107；若细胞数量＜107，请使用说明书
中建议的数量；若细胞数量≥107，则加大试剂用量（例如：若细胞数量为 2x107，则试剂用量为说明书建议用量的两倍）。
2.为 保 证 最 佳 分 选 效 果 ， 防 止 堵 塞 分 选 柱 ， 在 磁 分 选 前 使 用 30 μ m 滤 器(Pre-SeparationFilters # 130-041-407)过滤，去除细胞团块。
1）进行细胞计数；
2）300×g 离心 10 分钟，用移液枪吸去上清；
3）80 μL buffer 重悬细胞；
4）加入 20μL CD3 MicroBeads ，混匀，在 4-8℃冰箱中孵育 15 分钟；
5）用 1-2 mL buffer 洗涤细胞，300×g 离心 10 分钟，用移液枪吸去上清；
6）用 500μL buffer 重悬细胞；
上柱分选 ：
注意：根据总细胞数量和 CD3+细胞数量，选择合适的分选柱和分选器。
1）将分选柱放在分选器合适位置上；
2）润柱。MS 分选柱——使用 500µL buffer；LS 分选柱——使用 3mL Buffer。
3）用移液枪将样本加在分选柱上；
4）收集没有被磁珠标记的细胞，对于样本管/分选柱，用 500 µL Buffer 冲洗三次
MS 分选柱；用 3 mL Buffer 冲洗三次 LS 分选柱。
洗脱：
1）将分选柱移出磁场环境，放在新的 15mL 收集管上；
2）在分选柱上加适量的 Buffer（MS 分选柱：1mL；LS 分选柱：5mL），用分选柱配备
的活塞，快速的推下去，使得 Buffer 缓冲液能够将分选柱上被磁性标记的细胞洗脱下来，并收集在新的 15mL 收集管里，即为目的细胞（CD3+细胞）
狄光辉 13683842418
