Source:狄光辉Author:admin Addtime:2023/05/04 Click:
由于土壤中有机质含量丰富，尤其是其中的腐殖酸对RT-PCR等后续反应有极大的抑制作用，所以从土壤微生物提取高纯度的 RNA一直是十分棘手的问题。本产品具有下列特点：
1. 处理一个样品只需要约十几分钟。
2. 去污染效果好，RNA纯度更高，平均 OD260/280一般都在2.0左右。
3. 得到的RNA可直接用于 RT-PCR、Northern 杂交、cDNA 合成等实验。
4. 性价比高于进口的土壤 RNA 提取产品。
5. 试剂无毒无害, 环保。
6. 可以进行无氯仿操作，只是纯度稍微降低，但不影响使用。
本产品只能用于科研。
1. 称取 0.1-0.5 g 的土壤，加入 1 mL 土壤RNA纯化溶液A，震荡器上剧烈震荡 5-10分钟。注意:一定要让管底的土壤震荡起来。注意：溶解土壤RNA纯化溶液A沉淀。土壤RNA纯化溶液A在 4℃放置后可能会产生沉淀，使用前必须放在 65℃水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用。
2. 稍微静置后将上清液转移至一个干净的 1.5 mL 塑料离心管中。
3. 在离心管中加入 0.3 mL 的溶液B 和 0.2 mL 自备氯仿，在振荡器上振荡 30 秒混匀。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。
4. 室温 12000 rpm 离心 3-5 分钟。
5. 将上清液（约 0.6 mL）转移到另一干净的 1.5 mL 塑料离心管中，下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。最好留下 100 μL 上清液不取。
6. 在上清液中加入 0.5 mL 的溶液 C 和 0.2 mL 的自备氯仿，用手上下颠倒或振荡器振荡 30 秒混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。
7. 室温 12000 rpm 离心 3 分钟，两相间将有白色膜状物（蛋白质）形成。
8. 将上清液（约 1 mL）转移到另一干净的 1.5 mL 塑料离心管中,避免触及或吸取有机相及其上面的白色膜状物。
9. 在上清液中加入 0.5 倍体积的溶液D，用手上下颠倒或振荡器振荡 30 秒混匀，此时溶液呈白色浑浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。
10. 将一半的溶液转移到离心吸附柱中，套入收集管中厚 12000 rpm 室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
11. 将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中， 套入收集管中后 12000 rpm 室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
12. 加 0.5 mL 洗柱液，套入收集管中后室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
13. 加 0.5mL 洗柱液，套入收集管中后室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。此步可以省略。
14. 将离心吸附柱套入收集管中后室温离心半分钟，弃含穿透液的收集管。 15 可选步骤：（膜上消化 DNA）
15. 将 5Ul 的 RNase-free DNase 加入到 45ul DNase buffer 中混匀，加入到离心吸附柱中，室温放置 5-15 分钟（如果后续电泳检测DNA 污染没消化干净，可加大 DNase 的用量和室温放置时间延长）。
16. 直接在离心吸附柱中加 0.5ml 的去酶液，盖上盖后颠倒混匀。
17. 室温 12000 g 离心 1 分钟，弃穿透液。
18. 再加 0.5ml 的去酶液，12000 g 室温离心 1 分钟，弃穿透液。
19. 室温 12000 g 离心 2 分钟，此步非常重要，否则残留的乙醇会影响 RNA 的使用。
20. 将离心吸附柱套入到一个自备的 RNase-free 收集管中，加入 30-100 μL RNA 洗脱液，室温放置 1-2 分钟。
12000 rpm 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 RNA 样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
