Source:狄光辉Author:admin Addtime:2018/06/30 Click:
1.溶液I-溶菌液：
溶菌酶：
它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1，4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：
（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（D-Nase作用时需要一定的金属离子作辅基）；
（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2.溶液II-NaOH-SDS液：
NaOH：
核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的，但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。 在溶液II中的NaOH浓度为0.2mol/L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂。
它主要功能有：
（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。
（2）解聚细胞中的核蛋白。
（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3…R＋蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来，但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以，在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。
3.溶液III-3mol/L NaAc（pH4.8）溶液：
NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以，该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性， 使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol/LNaAc有利于变性的大分子染色体DNA、 RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合， 后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
4.为什么用无水乙醇沉淀DNA？
用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，
乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15～30分钟即可。
5.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？
在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。
6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？
加进去的R-Nase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全，也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除R-Nase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。
7.为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？
在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是Tris H+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定。氯仿的作用主要是使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇的作用是消除抽提过程中出现的泡沫。氯仿是强蛋白质变性剂，抑制RNA酶的活性，除去蛋白质污染。
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