Source:DNA提取试剂盒Author:admin Addtime:2019/06/20 Click:
【兽药名称】
通用名：非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒（产物降解备选）
商品名：产物降解PCR
英文名：African Swine Fever Virus Real-time PCR Detection Kit（Optional Amplicon Digestion)
汉语拼音：Feizhouzhuwenbingdu Yingguang PCR Jianceshijihe （Chanwu Jiangjie Beixuan）
【用途】
本试剂盒采用荧光实时监测PCR扩增方法检测非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）特异性基因片段，并且在检测完成后降解扩增产物，为非洲猪瘟病毒的诊断提供无污染的辅助手段。适用于ASFV的诊断、检测和流行病学调查。
【检验原理】
本试剂盒在DNA聚合酶的作用下，特异性扩增病毒DNA片段，用实时PCR仪检测荧光信号。根据扩增曲线的形状和Ct值判定检测样品中特异性片段的存在。扩增结束后降解反应管中预先添加的降解酶与扩增产物混合后孵育1小时后能有效降解扩增产物。
【PCR反应试剂盒组成】
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序号 |
组成成分 |
50头份/盒 |
贮藏 |
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1 |
扩增反应液 |
950μL |
-20℃ |
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2 |
扩增酶液 |
52μL |
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3 |
阴性对照品 |
50μL |
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4 |
阳性对照品 |
30μL |
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5 |
降解酶液 |
1100μL |
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6 |
产品说明书 |
1份 |
保存期: 本产品-20℃保存有效期为 12 个月；不同批号的试剂不可以混用或互用。
【适用仪器】
本试剂盒适用于各种实时荧光PCR仪，具备检测FAM的荧光通道即可。
【自备物品】
仪器及耗材: 荧光定量PCR仪、离心机、涡旋振荡器、组织研磨器及可调移液器（10/100/1000μL）。枪头（10/100/1000μL），1.5mL离心管， 0.2mL反应管及管架。建议核酸模板及阳性样品的枪头用带滤棉枪头，避免核酸气溶胶污染移液器内部。
【检验方法】
1. 适用样本类型
本试剂盒适用于检测血清、血浆、全血、脾、扁桃体、淋巴结、肌肉组织等样本。
2. 采集
2.1 血清样本采集
用无菌注射器抽取猪静脉血2mL，注入无菌收集管，待样本自行析出血清或以2000-3000rpm的速度离心10min出血清，转移至1.5mL离心管中备用。
2.2 组织样本采集
用干净灭菌器械采取病变典型组织，如患畜已死亡，应尽快采集，最迟不超过3h。每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后备用。
2.3 环境样本采集
污水、粪便、饲料、环境拭子等。
3. 保存
采集的待测样本可立即用于检测，待测样本在2～8℃保存不应超过三天；-20℃保存应不超过一个月；-70℃下可以长期保存。应避免反复冻融。
4. 样本处理
血清：取50μL血清到新离心管待用；
组织：取约0.05g组织（绿豆粒大小）至干净灭菌的匀浆器中，加入500μL样本稀释液充分研磨，取50μL匀浆液于新离心管待用；
环境样品如粪便、饲料、环境拭子等加150μL样本稀释液浸泡、研磨后离心取50μL液体，污水混匀离心取50μL液体。
5.样品核酸提取
采用DNA提取试剂或自动核酸提取仪提取各类样品中的核酸。低温保存待检样品。
友情建议：优选快灵生物病毒核酸提取试剂盒（过柱法）、快灵生物病毒核酸提取试剂盒（AB液裂解）。
6.扩增试剂准备
从试剂盒中取出扩增反应液、扩增酶液恢复至室温后振荡混匀，短暂离心5s。根据检测样本数（N=阳性+阴性+样本，预备分装N管），按下表在PCR反应管中配制N份反应体系。
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成分 |
体积 |
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扩增反应液 |
17μL |
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扩增酶液 |
1μL |
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模板（在步骤5加入） |
2μL |
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总体积 |
20μL |
7.扩增试剂加样
在分装有扩增反应液和扩增酶液共18μL的0.2mL PCR反应管或降解反应管底部分别加入2μL待检核酸及阳性对照、阴性对照后短暂离心（如用降解反应管须用专用离心转头），确认反应液内无气泡。扩增酶液含有UNG酶，用于降解扩增前可能的产物污染，适用于实验室轻度产物污染，如需启用该酶，须扩增程序“预变性”前增加50℃ 2min的孵育步骤。
特别注意：如需预防严重产物污染，可选择启用降解酶，在反应管上部区域的最大腔体中加20μL降解酶溶液。在操作过程中，应杜绝降解酶流入或混入PCR反应溶液。
8. 扩增程序
将反应管放置到荧光定量PCR仪内，记录加样顺序。
8.1 按下表设置反应条件
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阶段 |
温度时间 |
循环数 |
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预变性 |
96℃ 60S |
1 cycle |
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预循环 |
96℃2S，50℃2S |
10 cycles |
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预变性 |
96℃ 20S |
1 cycle |
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PCR扩增 |
95℃8S，60℃15S（采集荧光） |
35 cycles |
8.2 荧光通道的选择
报告基团“FAM”，淬灭基团“None”
【产物降解】
如需预防严重产物污染，可启用备选的产物降解酶。在装有18μL扩增反应液和扩增酶液的降解反应管底部加入2μL待检核酸液并短暂离心后，请从试剂盒内取出降解酶液，吸取20ul加入反应管上部区域的最大腔体中，然后再添加石蜡油10ul封闭管底部反应液即可闭合管盖启动扩增。在扩增结束后从扩增仪内取出降解反应管，上下颠倒震荡使管内上部的降解酶液与管底部的扩增反应液充分混合，将反应管放入40℃恒温箱或其他容器1小时以上，降解反应管内的扩增产物将被酶有效降解。
【结果判定】
实验成立条件：阳性对照的Ct值应＜30且出现特异性扩增曲线，阴性对照应无Ct值或Ct值≥34且无特异性扩增曲线，试验结果有效，结果判定如下：
阳性：被检样品对照的Ct值＜30且出现S形扩增曲线，判为阳性。
阴性：未出现S形扩增曲线，或被检样品无Ct值或Ct值＞34，均判为阴性。
可疑：被检样品30≤CT≤34并出现S形扩增曲线，判为可疑。建议重新取样提取核酸，扩增后进行结果判定。
【规格】50次/盒
【贮藏与有效期】-20℃以下保存，有效期为12个月。
【批准文号】
【生产企业】
【检验方法的局限性】
1. 当提取的核酸样品纯度偏低或提取试剂中的裂解组分残留较多时，本试剂盒检测结果会被干扰。
2. 检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的最低检出限时可能会发生假阴性的结果。
3. 被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成核酸降解而产生假阴性结果。
4. 样本在采集、运输、储存以及提取处理过程中可能发生交叉污染，导致样品交叉假阳性结果。
【注意事项】
1.为确保检测结果准确，请严格按照说明书操作。
2.避免裸手直接接触反应管，并避免在反应管的荧光采集部位进行任何标记。
3.实验流程为扩增试剂准备区→样本处理区→扩增区。严禁器材、试剂倒流。
4.将扩增酶液、扩增反应液保存于试剂准备区；稀释液、裂解液、阴阳性对照保存于样本准备区，每次实验应设置阴、阳性对照。
5.试剂使用前应常温融化、振荡均匀、短暂离心。试剂用后放回冰箱。反复冻融试剂将减低检测灵敏度，本试剂盒应在5次内用完。
6.所有用于检测的废弃物品均应放入含消毒液的废物缸内，浸泡消毒。
7.实验过程中，严禁使用外壁污染的容器和污染的手套进行实验。化学污染源要严格可控，及时收纳并化学处理深埋或焚烧。
8.反应体系中的气泡会影响荧光采集，加样后短暂离心可除去加样时带入的气泡。
9.上机前注意检查各荧光定量反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。
10.实验结束后立即消毒工作台。.
非洲猪瘟病毒 荧光PCR检测试剂盒（产物降解备选）：www.ex-dna.com
