核酸提取过程中蛋白酶K使用方法

蛋白酶K 

(Proteinase K) 
 

概述：蛋白酶K是一种非特异性、枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶，具有很高的比活性。EDTA等鳌合剂或SDS等去垢剂不能使蛋白酶K失活，该酶在较广的pH范围内(pH 4-12.5)均有活性。

 

来源：源于白色念球菌(Tritirachium album)。

 

应用：

 

用于质粒或基因组DNA的分离 
 

RNA的分离 
 

失活RNase, DNase以及反应中的其他酶类 
 

反应条件：蛋白酶K在较广的缓冲液pH范围(pH 4-12.5)、温度范围（37-60℃）、盐浓度（如：3 M GuHCl）或尿素(4 M)条件下均有活性。在一些去污剂如：Tween20(5%)、Triton X-100 (1%)和SDS(1%)条件下也有活性。

 

比活性：30 units/mg。

 

分子量：28.9 kDa。

 

单位定义：在250 μl反应体系，37℃条件下1分钟内能分解释放相当于1 μmol酪氨酸的folin-阳性氨基酸和肽所需要的蛋白酶K的量定义为一个单位(1)。

 

浓度：20 mg/ml。

 

贮存条件：20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM CaCl2和50%甘油。贮存于-20℃。

 

参考文献：

 

1. Anson, M.L. (1939) J. Gen. Physiol. 22, 79.
 

蛋白酶K消化裂解法适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组 织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌 物、尿，粪便等.

 

1.试剂配制

 

　　①蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)

　　10mmol/LEDTA

　　150mmol/LNaCL

　　0.5%SDS

　　100～200ug/ml蛋白酶K.
 

　　②蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，临用时加入消化液中.

 

2.提取方法

 

　　有些标本、在用蛋白酶K消化前，还需预处理一下，如粪便、分泌物、痰液、组 织块、石蜡包埋组织等，其方法有离心去掉杂质，脱蜡等.
 

　　临床标本或经预处理的标本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混匀，55℃1～3小时， 或37℃过夜.加等体积的饱和酚抽提1～2次，再加等体积的氯仿:异戊醇(49:1)抽提一 次，上清加入1/10体积的pH值5.23mmol/L醋酸钠缓冲液，加入2.5倍体积的冰冷无水 乙醇(或加等体积的异丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000转/min离心15min.小心吸 弃或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min离心洗涤1～2次，特别小心的 吸弃或倒掉上清，真空或37℃温箱或室温干燥，加TE缓冲液20ul.溶解后，取3～8ul 用于PCR扩增，或放-20℃保存.
 

　　蛋白酶K消化法除上述经典处理法外，亦可在蛋白K消化处理标本，经离心处理 后，吸取上清经95～97℃或煮沸10min灭活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR扩增. 如杂质较多，还可经酚:氯仿抽提后，即可用于PCR反应.此法蛋白质及其它杂质消除 彻底，Taq酶活性不受影响，具有良好的重复性与稳定性.但操作繁复，技术要求高.

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