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河南省洛阳市洛阳国家大学科技园
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。
3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒 DNA 的分离和纯化。
一 、实验目的
学习质粒DNA的制备原理。
掌握用碱变性抽提法提取与纯化质粒DNA操作技术。
掌握水平式琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA技术。
二、 碱变性小量制备质粒DNA的原理
利用宿主菌染色体DNA 与闭环双链质粒DNA 的结构状态的差异来提取质粒DNA。
在 pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将 pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体 DNA 、大分子量的 RNA 和蛋白质在去污剂 SDS 的作用下形成沉淀，而质粒 DNA 仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体 DNA 、 RNA 及蛋白质，质粒 DNA 尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA 。
三、质粒DNA的构型
四、碱抽提法提取质粒
第一步:使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁
Solution I 的配制：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA
第二步:溶液II 破坏细胞膜,蛋白质和DNA变性
Solution II 的配制:0.2N NaOH，1.0%SDS
第三步:中和溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀
Solution III的配制3M 醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）
第四步:离心除去沉淀
第五步:酚-氯仿抽提纯化DNA
第六步:沉淀DNA,0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇
葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。
EDTA是Mg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。
NaOH-SDS NaOH:强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。
SDS: 溶解，并结合细胞膜蛋白和细胞内蛋白成“蛋白-SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。
NaAc-HAc缓冲液,冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8用来中和NaOH变性液，使DNA复性,高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。
乙醇用于沉淀DNA。DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。
RNase A降解RNA渣滓，以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。
TE缓冲液，DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。
酚-氯仿蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。
大肠杆菌BL21(DE3)
质粒：pcDNA3.1+ with insert ~6.3kb
具体步骤：
1.吸取 1.5 ml 菌液， 13000 rpm 离心 1 分钟，收集菌体，倒掉菌液，保留菌体沉淀，用枪头尽量吸干残存液体。
2.加入250 ml buffer S1在混和器上振荡使菌体充分悬浮、分散、混匀。
3.每管加入250 ml Buffer S2，温和反转混匀，使细胞膜完全裂解，形成透亮溶液， 时间不超过5min。
4.每管各加350 ml Buffer S3，倒转几次混匀，此时酸中和碱，质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不溶性复合物，同时钾盐使游离SDS沉淀，13000rpm离心10分钟，沉淀染色体DNA及不溶的变性蛋白。
5.取上清转移至制备管(柱子置于 2ml 离心管中），13000rpm 离心1min，弃滤液。
6.将制备管置回离心管，加500 ml Buffer W1，13000rpm离心1min，弃滤液。
7.加700 ml Buffer W2，13000rpm离心1分钟，弃滤液，重复一次。13000rpm空转1min。
8.制备管移入一新的1.5ml离心管中，加入60 ml Eluent Buffer，室温放置1min， 13000rpm 离心1min收集质粒DNA。
质粒检测 (琼脂糖凝胶电泳)
在pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
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