1, 称取动物组织10g材料于研钵,冰浴剪碎。
2, 加入(20ml)0.14mol/L NaCL-EDTA溶液 ,研磨成浆状。
【DNP与RNP在不同电解质溶液中的溶解度有较大差异。0.14mol/LNaCL溶液,DNP几乎不溶。
防止DNA或RNA酶解。提取时加入乙二胺四乙酸(EDTA)。】
3,离心弃去上清液,收集沉淀(含DNP)。
4,(加入0.14mol/L NaCL溶液,和EDTA溶液,沉淀的两倍体积)重复离心、洗涤(纯化?)
5,(加入0.14mol/L NaCL溶液,和EDTA溶液)加入25%的SDS5ml,边加边搅拌。
【使核酸与蛋白质分离】
6,加入冷氯仿-异丙醇混合液,离心,上层水相(含DNA钠盐),中层变性蛋白质沉淀,下层氯仿混合液,用吸管小心吸取上层水相,弃去沉淀,重复步骤。
7, 取上清液5mL于烧杯中,加入95%的乙醇,玻璃棒顺时针转动,出现粘稠丝状物(DNA)
【乙醇沉淀DNA】
8, 取上清液2mL,加入0.5mol/L过氯酸溶液5mL,室温放置5min,加入二苯胺试剂2mL,混匀,60℃保温1h,生成蓝色化合物。
【二苯胺法鉴定DNA】
要点:
(防止核酸降解)
1,低温;
2,抑制核酸酶的活性:加入 柠檬酸纳,EDTA,SDS等;
3,避免剧烈震荡。
(核蛋白脱去protein的方法)
氯仿-异丙醇法、苯酚法、去垢剂法等使蛋白质变性核蛋白解聚,释放核酸。
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