在基因组学研究中,获得纯度高、完整性好的核酸提取产物进行基因结构和功能研究以及基因诊断是必不可少的重要步骤。
然而在实际工作中,往往由于待提取基因组样本的差异以及提取过程的诸多细节问题的忽略而导致提取结果不理想,从而直接影响下游实验的结果。特别是随着分子诊断领域的飞速发展,高通量、高效率的基因组DNA提取一直是困扰广大分子生物学工作者的难题。
因此,为解决这类问题,承包基因核酸提取的外包服务行业也就显得尤为重要。但即使有专门提取核酸基因的专业机构,也会存在提取效果不佳,结果不令客户满意的情况。
那为什么仍出现这类问题?
由我公司负责外包实验工作的专业技术人员总结出影响核酸提取工作效果的缘由与建议。
At First
橘生淮南则为橘,生于淮北则为枳。因为水土地方的不同,明明是同一种水果,但味道,外观,果肉却截然相反。同样的,即使是同一来源的样本,也会因为生长的环境、成长的周期、选取的部分以及对其的保存状态差异而影响核酸提取的效果。
就比如植物水生和陆生、幼苗和成熟植株;同一动物的不同组织器官以及微生物的致病类、不致病类等等,这些差异都会很明显的影响核酸提取的效果。而不单单只是因为人为操作的问题而影响实验结果!尽管,操作上的一些试剂选择,方法的选取也会影响提取效果,但样本自身的问题规避起来是要比人为操作来说困难的多。
这也是为什么实验开展之前,预实验的工作会如此的重要!
The Second
核酸分离、纯化原则——保持核酸分子一级结构的完整性。
实验结果出现的三类问题总结:
DNA样本不纯
DNA降解严重
DNA量少
这三类实验结果,应该也是每一个做核酸提取工作人员接触到的最常见的三种情况。针对这三类问题,我公司技术人员也给出了一定的分析与建议:
问题一:DNA样品不纯,抑制后续酶参反应
出现原因:
1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。
2.DNA在溶解前,有酒精残留,酒精抑制了后续的酶参反应。
3.DNA中残留有金属离子。
措施对策:
1.重新纯化DNA,去除蛋白、多糖、多酚等杂质。
2.重新沉淀DNA,让酒精充分挥发。
3.增加70%、80%乙醇洗涤次数。
出现原因:
1.材料不新鲜或反复冻融。
2.未很好抑制内源核酸酶的活性。
3.提取过程操作过于剧烈,DNA被机械打断。
4.外源核酸酶污染。
措施对策:
1.尽量取新鲜材料,低温保存材料,避免反复冻融。
2.液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液。
3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可以增加裂解液中螯合剂的含量。
4.细胞裂解之后的操作应尽可能轻柔。
5.试剂的配制与环境的卫生。
6.DNA保存在缓冲液中,避免反复冻融。
问题三:DNA提取量少
出现原因:
1.实验材料不佳,或量少。
2.破壁或裂解不充分。
3.沉淀不完全。
4.洗涤时DNA丢失。
措施对策:
1.尽量选取新鲜(幼嫩)的材料、加量。
2.动植物要匀浆研磨充分;G+菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。
3.高温裂解时,时间适当延长(对于动物细胞、细菌可增加PK的用量)。
4.低温沉淀并延长沉淀时间。
5.加辅助物,促进沉淀。
6.洗涤时用强力磁板架吸附,延长磁珠吸附时间。
以上是实验操作结果最为常见的三类问题。然而,在实验结果被实验技术人员认可的时候,到了客户那里还是不满意!
我们认为好的≠客户觉得ok
The Third
根据检测的手段与应用领域的方向,对提取核酸的浓度与纯度也有着不一样的要求。
技术人员根据客户一开始给定的样本进行实验,往往会疏于跟客户交流,也存在一类客户可能对自己要涉及的应用领域所需要的核酸要求不太了解,只知道越高越好,所以在提交实验结果时客户会不满意,表示没有达到我要的浓度和纯度,但在下游检测时,却也能做到满意的效果。
解决这一问题的关键是沟通!客户公司对核酸的严格质控变成了检验实验结果的一道屏障。首先,客户给定的样本状态会影响实验的效果,针对不同的样本提取效果必定不一样。其次,客户给定的要求脱离了实际需求,即所涉及的领域并不需要如此高的纯度或者浓度。这些都是需要与客户进行沟通解决。
核酸提取试剂盒磁珠法:www.ex-dna.com