FFPE样本核酸提取秘笈

今天小编在此为大家总结一些独家的FFPE核酸提取秘笈，帮助各位实验汪们征服FFPE样本~~

 

我们先来看一下FFPE样本核酸提取的实验流程：

FFPE样本的基因组和转录组是研究疾病发生发展的有效工具。因此必须对FFPE核酸提取实验的条件进行优化：
 

1.脱蜡的方法（脱蜡要彻底）
 

请一定要进行彻底的脱蜡！由于FFPE样本的特殊性，在处理样本的时候比新鲜组织多了脱蜡的过程。不同的脱蜡方法对产物的质量有重要的影响。虽然现在还很多科研工作者使用二甲苯和矿物油等有机溶剂进行脱蜡，但是它还是存在一定问题的，因为二甲苯是一种有毒的有机试剂，不仅容易造成

核酸片段化，核酸得率低，而且对操作者的人身安全有一定的威胁性。另外如果组织切片比较厚，超过10 μm，二甲苯等有机溶剂难以渗透，脱蜡效果不彻底。影响后续酶的消化效率。

 

推荐大家使用无毒含水的缓冲液，利用机械的方法进行快速乳化彻底脱蜡，防止核酸降解，保证核酸的完整性。

 

如果这个步骤未进行彻底脱蜡，石蜡会阻碍下个步骤消化液对组织的渗透，从而抑制蛋白酶K和组织内蛋白的接触，影响组织消化和DNA释放。

 

2蛋白酶K组织消化
 

 为了将DNA与结合的蛋白质分离，FFPE样本需经受高温和蛋白酶K消化。蛋白酶K可以消化蛋白质组分以及样品中可能存在的任何核酸酶，这个步骤还可防止DNA发生降解。

 

请一定对消化时间进行优化！消化的时间过短，DNA的释放不充分，导致核酸提取的得率低。不同的组织类型，组织大小都请使用不同的消化时间，必要时重复或孵育过夜。

 

请保证蛋白酶K与组织充分接触！如果是小于10μm的组织切片，推荐在56℃下与高质量的蛋白酶K孵育一个小时，并利用超声仪促进蛋白酶与组织充分接触，提高酶消化的质量。如果是大于10μm的组织切片，推荐延长消化时间，过夜孵育。
 

3.解交联
 

 前面提到FFPE样本制备中，福尔马林的固定作用容易使核酸和蛋白紧密交联。进行组织消化后样品已经变成水化状态，此时需要尽量在温和的环境下促进核酸和紧密交联的蛋白分开，释放DNA。建议在80℃的环境下，孵育样品一个小时，以达到逆转交联的目的。

 

4.核酸的提取和质控
 

核酸的提取有多种成熟的方法，包括酚氯仿抽提法、柱膜法、磁珠法等等。只需要根据自己的实验需要选择即可。请一定对提取出来的产物进行质控，大部分人提取FFPE核酸都是有明确的应用目的，比如下游进行微阵列芯片、NGS测序、Real-Time PCR等实验分析分子机制。因此不仅核酸的得率

要高，质量比如纯度和完整性也是大家关注的重点。使用化学溶剂进行脱蜡，解交联困难，生物大分子分分钟降解。即使是市面上广受追捧的试剂盒，不恰当的提取方法也会对核酸的得率和质量造成影响。特别推荐在提取核酸后进行质控，在条件摸索阶段尽可能监控整个流程，提高实验成功率。

 

那怎么进行质控呢？小编也都给大家整理好了：
 

1. 浓度：简单的浓度测量采用超微量紫外分光光度计（NanoDrop One，还可通过纯度比值了解样品中是否有抑制下游反应的污染物），或利用饱和染料标记双链DNA,用荧光光度计定量双链DNA浓度（如Qubit或ND3300）。
 

2. 定量PCR：这是判断一个核酸样品整体质量较好的方法。通过可扩增的DNA获取核酸定量、完整性等信息，诸如Illumina FFPE QC kit，通过ΔCq值来评判核酸质量。
 

3. 文库制备和测序：提高测序覆盖度和均一性。