土壤宏转录组学样本提取小技巧

提取土壤RNA是环境分子生物学研究最难也是最关键的步骤之一。RNA提取本身就是件艰巨的任务，提取土壤的RNA挑战更大。究其原因在于土壤RNA的低得率。从土壤中获得RNA远比DNA少，前者仅有后者的10-20%，所以相应的纯化方案一定要能容忍足够大的样本上样量。

另一个大问题是腐植酸等抑制因子的污染。RNA实验对纯度要求很高，当逆转录寻找低拷贝数基因时，你无法稀释RNA样品。要求加入反应体系中的RNA浓度足够高且不能含有抑制因子。

因此，MO BIO开发出了一套包含了多种方法的操作流程，以获得非常干净的RNA最大化地满足RT-PCR的需要。小编这次专门就以RNeasy PowerSoil Total RNA Kit试剂盒为例，分享实际使用中的一些小Tips，帮助您缩短实验摸索的过程。

酚氯仿异戊醇的比例必须严格遵照25：24：1并保存在pH8.0的TE缓冲液中。对于土壤样本，pH中性的苯酚更适用。

PCI裂解步骤后加入SR3溶液（第7步），下一步加入异丙醇沉淀总核酸。对于底泥样品，加完SR3溶液后总体积可能超过5ml。增加SR4的使用量（第9步），至与前步骤获得的样品体积相同，以保证充分沉淀核酸。

如果您的样本盐浓度较高，核酸沉淀步骤建议在室温下进行。冷冻样品沉淀的盐分，会改变阴离子交换离心柱上的核酸吸附条件。一般可从沉淀物中看出是否有盐分沉淀：正常的RNA沉淀表面平坦有光泽，若沉淀明显较大且表面有壳，表明有盐分沉积。

MO BIO在这款试剂盒中使用阴离子交换树脂来获得更高质量的RNA。因为使用重力纯化，有时溶液通过树脂的速度很慢，可以使用5ml注射器针管缓缓加压加速流动，但流速不应该超过1滴每秒。

SR5和SR6使用前必须充分摇匀。有些含有异丙醇的溶液静置会分层，使用前只要充分摇匀即可。

从纯化柱中洗脱下来的RNA加入SR4溶液做最终沉淀。此步必须在-20℃孵育。

离心分离RNA，正常RNA沉淀应小而呈玻璃光泽。离心时所有的Tube管要朝向一致，以便于倒出异丙醇时迅速辨认RNA沉淀。晾干RNA沉淀步骤需要快速完成。建议在超净台中把Tube管倒置在吸水纸上。

考虑到需要做平行组学分析的用户需求，MO BIO特别设计了可以将纯化柱上DNA洗脱并进行额外纯化的配套试剂盒。

通常实验会使用RNAlater来保证样品中RNA的稳定性。然而RNAlater并不兼容土壤。经测试RNAlater在不同温度和时间下对土壤RNA的保护效果，结果发现随着保存时间的延长，RNAlater会令土样释放出更多的腐植酸，粘附并与RNA共同吸附于阴离子交换柱上难以去除。保存的时间越长，样品颜色变得越深。因此，我们推荐采样时使用LifeGuard Soil Preservation Solution对土壤RNA进行保护，并且在运输过程中能保证微生物结构稳定不变。

土壤RNA提取试剂盒：www.ex-dna.com

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