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河南省洛阳市洛阳国家大学科技园
Q1：何时应该在大量分离方法（如平移或磁珠分离）上使用流式分选？
A：
a）当需要非常高的纯度（95％-100％）的目标群体时。
b）用于分离其表面上具有低密度受体的群体。
c）根据表面受体密度浓缩表达量不同的群体。
d）基于多色染色分选细胞。
e）基于内部染色（例如DNA或胞内抗原）分选细胞。
Q2：我的细胞会被分选所伤害吗？
A：一般来说，细胞不会受到分选过程本身的伤害，只要它们保持在最适合它们的温度、pH值以及培养基中。
Q3：我需要准备好多少个细胞来分选出1×10E6个目标细胞，原细胞群包含10％目标细胞。
A：1 X 10E6 = 10％目标群体×50％回收率×20×10E6起始细胞数。 50％的回收率是一个合理的数字，但是用回收细胞的实际效率取决于许多因素：
a）由于细胞粘附管壁造成的分选前和分选后的丢失。
b）分选速率。分选速率越高，回收率越低。
c）流式细胞仪的分类精度。
d）如果是浓缩分选或纯度分选。浓缩分选比纯度分选有更高的回收率。
Q4：有办法提高分选回收率吗？
A：有。
a）使用聚丙烯管进行进行细胞处理和分选。
b）在分选之前（全部洗涤完毕后）计数细胞。
c）使用空白Hank's液做鞘液，不要用PBS。
d）使用聚丙烯收集管，并用含有20％血清的培养基填充1/3以上体积。
e）摸索最佳温度（4°C或15°C或室温）。
f）分选时每一个小时倒转一次管子。
g）分选时收集管如果满了或者分选结束时，立即处理收集管。
h）离心收集管的时间限定在〜10分钟
Q5：单克隆抗体标记细胞时，是否必须按照常规染色时细胞数:抗体量的比例进行计算抗体用量？
A：我们的经验表明，在体积为0.5 ml的缓冲液中孵育2～3千万个细胞，先按照常规染色的细胞数:抗体比例计算出理论用量，只需要用理论用量的1/4～1/5即可。
Q6：平均分选需要多长时间？
A：平均分选需要大约1小时设置仪器、约15分钟设置分选区域、约30分钟进行分选后分析。 分选20×10E6个细胞的分选需要2到4个小时， 然而实际时间与样品中目标细胞的百分比、研究者要求的纯度、细胞数等密切相关。进行无菌分选时，流式细胞仪的设置时间约为90分钟。
Q7：是否可以同时分选阳性细胞和阴性细胞？
A：是的，两类细胞可以分别收集到左边和右边的分选管中。 还可以将靶细胞收集到一个管中，将剩余的所有细胞连同废液收集到另一个收集管中。
Q8：实际上可以有多少比例的细胞可被回收，回收率取决于什么？
A：一般来说，预计理论细胞数量的50％可以被回收。 回收率的高低是由Q3答案中已经讨论的因素造成的。
Q9：如何在分选过程中确保细胞活力，有什么改进方法吗？
A：样品应保存在最适合它们的富营养培养基中。一般建议血清浓度尽量高一些，因为在分选过程中，血清浓度会被收集到管中的鞘液稀释。收集管尽量保持在最佳温度，并含有用于保存细胞活力的培养基。在分选完成后尽快处理分选后的细胞有助于保持细胞活力。
Q10：分选中细胞重悬最佳培养基和最佳浓度是否能推荐？
A：我们一般用含有25 mmol Hepes和2％～10％血清的RPMI 1640重悬细胞，细胞密度约6～8×10E6/ml，这样可以在低压力下分选样本，提高细胞群分辨率。不过，对于倾向于过度聚集的细胞，可以用更低密度，例如4～5×10E6/ml重悬细胞。
Q11：每秒可以在FACStar流式细胞仪上分选多少个细胞？
A：仪器上的最大事件发生率是每秒10000个事件。对于高纯度，每秒2500次的事件是典型和可取的。
Q12：可以分选出细胞的最大纯度是多少，它取决于什么
A：最高纯度为99％至100％。对于分群良好的细胞群体，可以预期95％至100％的纯度。纯度主要依赖于流式细胞仪的稳定性和分选门的设置方式。这些门应始终与研究者一起设置，以帮助作出决定。
Q13：是否可以进行无菌分类，并将分选后的细胞进行培养？
A：是的。如果有可能，尽量从分选后的细胞中分出多瓶进行培养，即使其中一瓶培养时污染，其它瓶子也可以继续培养。
Q14：是否有可能分选出<1％的细胞群，是否需要在分选前进行富集？
A：可以的。可以进行稀有事件分选，但是通过纯度较低、得率较低。因此，如果有可能，尽量通过各种方法或浓缩分选来富集。
Q15：可以通过加入碘化丙啶来排除分选细胞中的死细胞，对分选细胞是否有毒性？
A：活细胞可以通过加入低浓度碘化丙啶（PI）排除死细胞获得。我们实验室尚未确定PI对活细胞的毒性作用，但效果应该是小的，因为PI仅被动地附着在活细胞上，应该通过洗涤来移除。另一种死活鉴别染料7-AAD也是同样道理。
Q16：FACStar流式细胞仪可以同时使用多少参数进行分选？
A：目前可用的参数数为6：四个荧光参数、前向散射和侧向散射。荧光面积和宽度、参数之间的比例可能会在未来作为分选参数使用。
Q17：分选细胞群的纯度如何确定？
A：通过流式细胞仪再获取一点细胞，分析分选后细胞的比例。