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烟丝提取试剂盒提取的难点和优化方案

Source:狄光辉Author:admin Addtime:2023/06/29 Click:
CTAB法是一种从高等真核生物细胞中制备基因组DNA(总DNA)的技术。CTAB能跟核酸形成复合物,在高盐溶液(>0.7mol/L的NaCl溶液)中可溶并且稳定存在,当降低溶液中盐的浓度(<0.3mol/L的 NaCl溶液),CTAB - 核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀,再用70% 酒精浸泡可洗脱掉CTAB;氯仿能使蛋白质发生变性而沉淀。

但是酚和氯仿有毒,所以成品化商业试剂盒不选用这种试剂盒。

同样烟草作为植物的种,含有多糖多酚,我们选用烟草提取试剂盒选用ctab法作为基础,再此基础上进行改良和验证,烟丝作为烟草的烘干产品,DNA降解严重,要想提取到合格的DNA是需要下一翻功夫的。

酚类物质的纯化
 
烟叶组织中果实部分以及树木类植物中富含酚类化合物,其会随着植物器官的增长而增加,此外针叶类植物中所含有的酚类化合物要比落叶植物的叶子中更多。植物组织经破碎处理后,释放酚类物质,随后酚类物质被氧化,氧化后的处理液逐渐变为褐色,并随氧化程度的增加而加深,这一过程被称为褐化效应,而酚氧化后形成的醌能与DNA结合,导致DNA活性丧失,而用苯酚、氯仿抽提时,核酸还会丢失或形成不溶性复合物,从而影响RNA的分离纯化。
 
1.植物组织采集过程中应尽可能采集幼嫩组织,对组织进行冷冻保存,并在短时间内提取RNA;对于采集回的样品如要长期保存,应经液氮处理后储存在-80℃冰箱,且在样品与裂解液接触前,应防止冷冻的样品解冻,否则酚易被氧化成醌。
 
2.为防止多酚氧化,在裂解样品的同时可以加入适量的抗氧化剂。
 
β-巯基乙醇是个不错的选择,它可以抑制氧化反应;
 
多糖类物质的纯化
 
多糖作为植物细胞的结构组成和营养物质在植物细胞中大量存在,它是干扰植物RNA提取的主要因素,它的许多理化性质与RNA相似,因此很难将它们分离。另外多糖可与DNA结合形成胶状物质,这不但影响实验的操作,而且可以通过引起酶的活性中心改变或必需基团的改变而抑制酶的活性,严重影响分子生物学实验的后续工作。
 
1.在常规的提取方法中,通过盐酸胍处理可以去除部分多糖;在高浓度Na+或K+存在条件下,通过苯酚、氯仿也可以除去一些多糖;此外还可以通过LiCl沉淀DNA,将部分多糖保留在上清液中,但该法易丢失miRNA。但即使通过这些方法仍会有相当大一部分多糖与RNA缠绕在一起难以分离,所以需要更有效的解决方案。
 
PS:如果组织样品属于淀粉含量较高的植物样品,如马铃薯、甘薯的块茎、香蕉等,推荐:RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒,如果是苹果、桃子、樱桃、番茄等普通的多糖类植物。
 
蛋白质纯化
 
 
RNase和多酚氧化酶都属于蛋白质,要想获得高质量、完整的RNA,必须对有蛋白质污染的样品RNA进行纯化操作。
 
1.裂解液中加入蛋白质变性剂,如异硫氰酸胍,2-巯基乙醇,SDS等可去除大部分蛋白质。
 
2.可以利用蛋白酶K降解蛋白质,最后再用苯酚/氯仿除去残留的蛋白质。
次级代谢产物的纯化
 
次生代谢产物是指某些生物利用某些初生代谢产物为原料,在一系列酶的催化下,形成一些特殊的化学物质,这些化学物质即为次生代谢产物,这是一类非生长所必需的小分子有机化合物,但对于植物自身在复杂环境中的生存和发展起着不可替代的作用,如生物碱、黄酮类、萜类、有机酸、木质素等。
 
许多高等植物尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物,这些产物很容易与RNA结合并被共同抽提出来,进而阻碍RNA的分离。

因不确定这些代谢产物具体是什么物质,目前还没有特别好的方案来解决这一问题,不过大家可以尝试使用选择性沉淀来纯化。
 
本公司设计的烟丝专业核酸提取试剂盒针对烟丝特点,做了针对性优化。采用磁珠法进行核酸提取,适用烟丝基因组DNA提取,能最大限度去除基因组DNA中的多糖、多酚复合物及酶抑制剂等杂质。所得基因组DNA完整性高、片段大而纯度好,样品质量稳定可靠,无蛋白质和核酸酶等污染,可直接应用于各种下游实验,包括指纹图谱的测序等。通过配套自动化设备,本品还可实现基因组DNA高通量自动化提取。
 
适用从各种烟丝中提取基因组DNA;
 
操作简便,得率高,纯度好;
 
有效去除多糖、酚、以及此生代谢物对DNA提取的影响。

详情可联系狄光辉13683842418